老年性黃斑變性（AMD）、視網(wǎng)膜色素變性（RP）等視網(wǎng)膜變性疾病是目前尚無(wú)有效治療手段的兇險致盲性眼病，也是公認的“視力殺手”。由中南大學(xué)愛(ài)爾眼科學(xué)院院長(cháng)唐仕波教授、愛(ài)爾眼科研究所副所長(cháng)陳建蘇教授帶領(lǐng)團隊，利用誘導多能干細胞（iPS）條件培養基和飛秒角膜透鏡，聯(lián)合構建高活性視網(wǎng)膜色素上皮細胞（RPE）的研究，不但有利于對視網(wǎng)膜色素上皮細胞生理特性、藥物篩選等研究，還有利于構建組織工程視網(wǎng)膜層及其移植。這將幫助科學(xué)家開(kāi)發(fā)出應用組織工程RPE細胞片治療視網(wǎng)膜變性疾病和光感受器病變的新方法。

培養高活性的視網(wǎng)膜細胞

與年齡相關(guān)的老年性黃斑變性是發(fā)達國家50歲以上人群視力損害和致盲的首要病因，多達90%的病人無(wú)法治愈。數據顯示，發(fā)達國家年齡50歲以上黃斑變性的發(fā)病率達11%，目前我國的發(fā)病率接近發(fā)達國家，患病人數超過(guò)3000萬(wàn)人，并以每年30萬(wàn)人次的速度增加，成為我國現階段50歲以上年齡群體發(fā)病率最高的三大眼科疾病之一，而且女性呈現出比男性更高的危險性。

研究發(fā)現，未來(lái)最有希望治療老年性黃斑變性的方式是視網(wǎng)膜色素上皮細胞療法、視網(wǎng)膜黃斑部分的移植。那么，要采用RPE療法，就需要先培養健康的視網(wǎng)膜細胞。

陳建蘇告訴科技日報記者，取出死亡時(shí)間在3小時(shí)內捐獻者的帶有部分脈絡(luò )膜的視網(wǎng)膜組織，在解剖顯微鏡下可將帶有部分脈絡(luò )膜的RPE層從捐贈組織中分離出來(lái)，并培養出RPE細胞?！氨狙芯客ㄟ^(guò)半定量蛋白芯片分析鑒定，發(fā)現了包括血小板衍生生長(cháng)因子AA（PDGF-AA）、胰島素樣生長(cháng)因子結合蛋白2（IGFBP-2）等因子，在誘導多能干細胞上清液中，含量顯著(zhù)增高，從而獲得大量增殖能力強、高活性及具有良好功能的RPE細胞?！?/p>

獲得類(lèi)似視網(wǎng)膜自然結構的片狀組織

正常眼內的RPE細胞，是緊密連接的單層細胞，只有移植單層RPE細胞才有可能提高其存活率并發(fā)揮功能?；谶@個(gè)原因，研究團隊開(kāi)始利用組織工程的方式，嘗試體外構建具有功能的RPE細胞片。

基因整合是指把兩個(gè)非同源基因連接起來(lái)。愛(ài)爾眼科團隊針對視網(wǎng)膜變性疾病展開(kāi)進(jìn)一步的研究，從患者的尿液、血液提取體細胞，進(jìn)行體外擴增培養，并通過(guò)非基因整合型的方式進(jìn)行重編程轉化，將患者的尿液、血液來(lái)源的細胞逆轉為具有自我復制及分化能力的誘導多能干細胞。

“通過(guò)研究，對轉化成功的尿液、血液來(lái)源的誘導多能干細胞，進(jìn)行傳代純化并通過(guò)多能性基因表達、干性蛋白標志物免疫熒光及體外擬胚體試驗等方法進(jìn)行鑒定，確認產(chǎn)生的誘導多能干細胞具有多向分化的能力?！睈?ài)爾眼科學(xué)院助理研究員顧佳寧說(shuō)，后續通過(guò)3D分化培養方式，用不同的培養基對誘導多能干細胞進(jìn)行視網(wǎng)膜方向的定向誘導分化，獲得視網(wǎng)膜器官發(fā)育的類(lèi)似組織。并對其中出現色素表達的細胞，進(jìn)行分離培養，得到RPE細胞，通過(guò)培養形成一層超薄的類(lèi)似視網(wǎng)膜自然結構的片狀組織。

“但目前尿液及血液細胞的各種重編程方法效率均不高，往往要觀(guān)察半個(gè)月以上，才能確定是否重編程成功。因此，獲得患者體細胞來(lái)源的iPS細胞并不容易?！标惤ㄌK解釋說(shuō)，對iPS細胞的誘導分化存在多種影響因素，如初始細胞的密度及iPS細胞狀態(tài)等。因此，通過(guò)iPS細胞誘導分化得到的RPE細胞色素表達情況不穩定，還需進(jìn)一步控制各個(gè)變量，獲得穩定分化成優(yōu)質(zhì)RPE細胞的誘導方法。

變角膜透鏡為支架材料

一個(gè)成功的RPE細胞片應具備三要素，即種子細胞、培養系統和支架材料。除了高活性的種子細胞外，支架材料可有效保證細胞的黏附性，以及在移植時(shí)可確保細胞以正確的方向面對光感受器細胞。于是，研究團隊把全飛秒激光近視手術(shù)中切下取出的角膜基質(zhì)透鏡“變廢為寶”，提高了其再利用價(jià)值。研究發(fā)現，當RPE細胞接種在角膜基質(zhì)透鏡上，并應用誘導多能干細胞條件培養液培養，可以使RPE細胞片具有更多的干細胞特性、完善的纖毛組裝以及成熟功能。

此外，團隊還采用3D細胞培養、類(lèi)器官等新技術(shù)，建立眼遺傳病患者疾病細胞模型，探明眼病發(fā)病和發(fā)展的機制及規律?；诎l(fā)病機理分析，對現有藥物做出個(gè)體化評估，以及發(fā)現新的治療靶點(diǎn)和篩選新藥物，獲得眼遺傳病及其他眼病新的治療方案。

“幾十年來(lái)，干細胞一直有望治愈疑難雜癥。該項研究將加速推動(dòng)更安全的誘導多能干細胞療法的發(fā)展，同時(shí)，實(shí)驗已經(jīng)證明了該項技術(shù)的安全性、有效性，為進(jìn)行人體臨床試驗提供了充足依據?！碧剖瞬ㄕf(shuō)。